使用LC液相色譜儀時，液體待檢測物被注入色譜柱，通過壓力在固定相中移動，由于被測物種不同物質與固定相的相互作用不同，不同的物質順序離開色譜柱，通過檢測器得到不同的峰信號，zui后通過分析比對這些信號來判斷待測物所含有的物質。LC液相色譜儀作為一種重要的分析方法，廣泛地應用于化學和生化分析中。液相色譜從原理上與經典的液相色譜沒有本質的差別，它的特點是采用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測器和微粒固定相，適于分析高沸點不易揮發、分子量大、不同極性的有機化合物。

 

　　LC液相色譜儀的構造

 

　　液相色譜系統主要由流動相儲液瓶、輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器和記錄儀組成，其整體組成類似于氣相色譜，但是針對其流動相為液體的特點作出很多調整。液相色譜的輸液泵要求輸液量恒定平穩，進樣系統要求進樣便利、切換嚴密。同時，由于液體流動相黏度遠遠高于氣體，為了減低柱壓，液相色譜的色譜柱一般比較粗，長度也遠小于氣相色譜柱。

 

　　LC液相色譜儀它包括空柱和填料。空柱是內壁拋光的不銹鋼管，內徑為4～5mm，長100～250mm。按氣相色譜法中洗滌空柱的方法洗凈，用勻漿法填充固定相。將此柱裝入儀器的管路中，用柱式機械往復泵輸入新鮮脫氣的流動相。

 

　　等基線平直后可用苯、萘、菲的混合試液，用正己烷（含 0.05%甲醇）或甲醇：水（83：17）為流動相測定柱效及分離度塔板數在2～3萬/ml以上及分離度在1.5以上者，柱效好。為防止柱污染，常用1個 50mm長，4~5mm內徑，裝有硅膠（40-50mm）或立柱相同填料的保護柱（預柱）接在主柱之前，以延長色譜柱的壽命。反相鍵合相柱用畢。必須用水充分流經，以洗去鹽類、酸堿等雜質防止柱生銹及填料中雜質的積聚，再用甲醇流經洗滌使色譜柱獲得再生。

 

　　流動相的洗脫方式配好經脫氣的流動相放于貯液瓶中，經過有濾過頭、內徑2mm的聚四氟乙烯管流入高壓泵進入色譜柱，zui后自檢測器流出或收集或作廢液回收。用流動相洗脫的方式有恒溶劑脫洗法，即自洗脫開始到結束，溶劑的配比恒定。

 

　　另一類為梯度洗脫法，即使溶劑的極性強度在色譜過程中逐漸增加。須按一定程序不斷改變流動相的濃度配比，從而使同一個試樣中組分性質相差較小的及較大的都能在一次色譜過程中很好分離，而整個色譜過程縮短。必須注意，梯度洗脫法不能用于分子排阻色譜及用電化學檢測的反相液相色譜法中。

 

　　LC液相色譜儀是一類分離與分析技術，其特點是以液體作為流動相，固定相可以有多種形式，如紙、薄板和填充床等。在色譜技術發展的過程中。為了區分各種方法，根據固定相的形式產生了各自的命名，如，紙色譜、薄層色譜和柱液相色譜。

 

　　LC液相色譜儀的使用和維護注意事項：

 

　　①避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內填料，因此在調節流速時應該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉動不能過緩。

 

　　②應逐漸改變溶劑的組成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑改變為全部是水，反之亦然。

 

　　③一般說來色譜柱不能反沖，只有生產者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質。否則反沖會迅速降低柱效。

 

　　④選擇使用適宜的流動相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。

 

　　⑤避免將復雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內，需要對樣品進行預處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱。

 

　　⑥經常用強溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內的雜質。

 

　　⑦保存色譜柱時應將柱內充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發干燥。禁止將緩沖溶液留在柱內靜置至次日或更長時間。

 

　　⑧色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是濾片被堵塞，這時應更換濾片或將其取出進行清洗；另一種可能是大分子進入柱內，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現塌陷，死體積增大。

 

　　⑨以硅膠為基質的填料，只能在pH2~9范圍內使用。每次分析檢測完成后，用洗脫能力強的洗脫液沖洗，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡。

 

　　對LC液相色譜儀的要求

 

　　1、流動相必須用HPLC級的試劑，使用前過濾除去其中的顆粒性雜質和其他物質（使用0.45μm或更細的膜過濾）。

 

　　2、流動相過濾后要用超聲波脫氣，脫氣后應該恢復到室溫后使用。

 

　　3、不能用純乙腈作為流動相，這樣會使單向閥粘住而導致泵不進液。

 

　　4、使用緩沖溶液時，做完樣品后應立即用去離子水沖洗管路及柱子一小時，然后用甲醇（或甲醇水溶液）沖洗40分鐘以上，以充分洗去離子。對于柱塞桿外部，做完樣品后也必須用去離子水沖洗20mL以上。

 

　　5、長時間不用儀器，應該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應該用有機相（如，甲醇等），因為，純水易長霉。

 

　　6、每次做完樣品后應該用溶解樣品的溶劑清洗進樣器。

 

　　7、C18柱不能進蛋白樣品，血樣、生物樣品。

 

　　8、堵塞導致壓力太大，按預柱→混合器中的過濾器→管路過濾器→單向閥檢查并清洗，清洗方法：

 

　　①以異丙醇作溶劑沖洗；

 

　　②放在異丙醇中間用超聲波清洗；

 

　　③用10％稀硝酸清洗；

 

　　9、氣泡會致使壓力不穩，重現性差，所以在使用過程中要盡量避免產生氣泡。

 

　　10、如果進液管內不進液體時，要使用注射器吸液：通常在輸液前要進行流動相的清洗。

 

　　11、要注意柱子的pH值范圍，不得注射強酸強堿的樣品，特別是堿性樣品。

 

　　12、LC液相色譜儀更換流動相時應該先將吸濾頭部分放入燒杯中邊振動邊靖洗，然后插入新的流動相中。更換無互溶性的流動相時要用異丙醇過渡一下。